感染性疾病是當(dāng)今世界嚴(yán)重要挾人類安康的嚴(yán)重疾病。目前，全球感染性疾病的發(fā)病率有所上升，病原體出現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化的開展趨向。近年來快速開展的NGS技術(shù)因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設(shè)計(jì)，可直接對(duì)未知病原微生物停止檢測(cè)，打破了傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)的局限性，在臨床微生物范圍展現(xiàn)了寬廣的前景。

感染性疾病簡介

感染性疾病多為細(xì)菌、病毒和真菌等病原體及其產(chǎn)物所惹起的局部或全身性炎癥或器官功用阻礙，具有較大的危害性和較高的病死率。目前，全球感染性疾病的發(fā)病率有所上升，病原體出現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化的開展趨向。

重癥急性呼吸綜合征、新型冠狀病毒感染、新變異型克雅病、H7N9 禽流感等新發(fā)感染性疾病不時(shí)出現(xiàn)。而HIV、多重或廣譜耐藥的結(jié)核分枝桿菌、沙眼支原體等經(jīng)典感染性疾病病原體又死灰復(fù)燃或出現(xiàn)新的致病特征。各種新發(fā)和再發(fā)的感染性疾病、不易發(fā)現(xiàn)的多重感染以及不明病因的發(fā)熱等，都給人類安康帶來了龐大的要挾，因此，臨床上對(duì)感染性疾病診斷的準(zhǔn)確性和時(shí)效性提出了更高的要求。

感染性疾病診斷現(xiàn)狀

快速、準(zhǔn)確的診斷是有效治療、病情監(jiān)測(cè)和控制疾病蔓延的重要前提。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的不時(shí)開展和完善，分子檢測(cè)在病原微生物感染診斷及治療監(jiān)測(cè)上的臨床運(yùn)用日益普遍，已成為一些重要的感染性疾病的診斷和療效評(píng)價(jià)中不可缺少的重要工具。目前常用的病原微生物分子檢測(cè)方法主要包括：基于PCR的電泳法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QPCR）、數(shù)字PCR、基因芯片技術(shù)、測(cè)序技術(shù)（Sanger測(cè)序技術(shù)、焦磷酸測(cè)序技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)）等。

在感染性疾病范圍中，取得病原體的活體（關(guān)于細(xì)菌、真菌、病毒而言，主要是培育陽性），是感染性疾病診斷的金規(guī)范，但病原體的體外培育耗時(shí)普遍較長，操作步驟繁瑣，且絕大少數(shù)病原體不可培育；免疫學(xué)方法（如補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、中和實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、免疫熒光法和酶標(biāo)斑點(diǎn)免疫法等）操作復(fù)雜，但由于病原體種類單一，已研發(fā)的抗原、抗體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需求；PCR 檢測(cè)具有極高的靈敏度和特異性，但無法完成高通量篩查，檢出率較低；基因芯片技術(shù)只能對(duì)已知的病原體基因組停止意向性篩查， 而無法檢測(cè)新的未知病原體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約70%的感染性疾病患者因傳統(tǒng)檢測(cè)方法無法確定病原體信息，不能失掉及時(shí)有效地救治，從而使病情好轉(zhuǎn)。因此，快速、特異且高通量的病原體檢測(cè)方法，對(duì)有效診斷和及時(shí)防治感染性疾病具有重要的意義。

近年來快速開展的NGS技術(shù)因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設(shè)計(jì)，可直接對(duì)未知病原微生物停止檢測(cè)，打破了傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)的局限性，在臨床微生物范圍展現(xiàn)了寬廣的前景。

NGS 在臨床微生物檢測(cè)中的運(yùn)用

1. 感染性疾病的病原體鑒定

傳統(tǒng)的病原微生物鑒定方法主要有涂片鏡檢、分別培育、生化反響和質(zhì)譜等方法，但其存在周期長、進(jìn)程復(fù)雜及靈敏度高等缺陷，如分枝桿菌菌種鑒定需求長達(dá)30～40 d的時(shí)間，而一些苛養(yǎng)菌及病毒對(duì)培育條件要求*苛刻，甚至不能培育。以PCR 為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)處置了上述局部病原體鑒定的效果，但難以處置未知微生物的檢測(cè)難題未知微生物在未知核酸序列時(shí)無法設(shè)計(jì)引物，成為這類技術(shù)的*阻礙。NGS檢測(cè)則無需對(duì)病原體停止分別培育，也不依賴已知核酸序列，可直接對(duì)標(biāo)本停止測(cè)序鑒別，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，提高了診斷效率，在對(duì)未知物種及難以培育的病原體鑒定方面具有無與倫比的優(yōu)勢(shì)。

NGS 在病原體鑒定方面的運(yùn)用主要有2種方式 ， 即rRNA基因測(cè)序和全基因組測(cè)序（whole genome sequencing, WGS）。rRNA 基因測(cè)序在臨床上常用于細(xì)菌、真菌的鑒定，同時(shí)也是菌群剖析的基礎(chǔ)。WGS與rRNA基因測(cè)序相比，可獲取的信息愈加片面，適用于病毒鑒定。因大局部病毒不可培育，且高度變異，NGS 與 Sanger測(cè)序、基因芯片等法相比，效率更高，且無需設(shè)計(jì)特定探針，更適宜用于復(fù)雜臨床標(biāo)本中的病毒鑒定。

2. 病原體分型及盛行溯源

病原體分型方法包括基因組重復(fù)序列擴(kuò)增、隨 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA、脈沖場凝膠電泳、多位點(diǎn)序列分型技術(shù)等。這些技術(shù)可檢測(cè)病原體的型別，但分辨率較低，關(guān)于相似或變異度極高的病原體如病 毒等則常無法區(qū)別，而 NGS則補(bǔ)償了此項(xiàng)缺陷，其可檢測(cè)病原體全基因組序列，取得全部遺傳信息，被以為是分辨率*的病原體分型方法。近年來，隨著抗生素的不規(guī)范運(yùn)用甚至濫用，使細(xì)菌耐藥狀況日益突出，耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的爆發(fā)盛行時(shí)有發(fā)作。因此，對(duì)盛行細(xì)菌停止追蹤和溯源十分重要。在對(duì)耐藥菌等病原體停止分型的基礎(chǔ)上，判別同源性遠(yuǎn)近，分辨出不同的退化路途，可追蹤或預(yù)防盛行性疾病的大爆發(fā)。

3. 病原體耐藥及毒力特征檢測(cè)

在抗生素和宿主免疫等多重要素的壓力下，病原體在毒力和耐藥方面均發(fā)作了相應(yīng)改動(dòng)。各種高毒力株及耐藥株的出現(xiàn)是招致感染性疾病發(fā)病率和病死率居高不下的重要緣由。臨床上病原體耐藥及毒力特征的檢測(cè)慣例采用體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、耐藥菌表型檢測(cè)或核酸擴(kuò)增等方法。這些方法操作繁瑣，且較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。NGS 通量高、快速，在一次測(cè)序反響中即可取得細(xì)菌整個(gè)基因組的耐藥、毒力等相關(guān)基因信息，同時(shí)還可對(duì)目的基因、基因定位、基因環(huán)境、質(zhì)粒相關(guān)序列等展開片面研討，有助于提醒病原體毒力及耐藥機(jī)制，對(duì)臨床治療及指點(diǎn)用藥均具有重要意義。

4. 與人體疾病相關(guān)的微生態(tài)失衡宏基因組

宏基因組學(xué)（Metagenomics）以微生物生態(tài)群落中一切微生物的基因組為研討對(duì)象，經(jīng)過研討群落中物種組成和功用組成、同一個(gè)群體內(nèi)不同微生物的相互作用、微生物群落與宿主之間的相互作用，并停止不同表型的樣品比擬、剖析，來解釋生物學(xué) 現(xiàn)象。近年來，NGS 技術(shù)越來越普遍地被運(yùn)用于腸道微生物范圍的宏基因組學(xué)研討。多項(xiàng)研討標(biāo)明，腸道菌群與宿主共生并共退化的進(jìn)程中，在營養(yǎng)、代謝及免疫等多個(gè)方面影響著人體安康。腸道微生態(tài)失衡與人體多種疾病，如感染性疾病、瘦削癥、糖尿病、肝病、冠心病及腫瘤等之間存在親密關(guān)系。

腸道微生物宏基因組學(xué)研討則為研討腸道微生物與相關(guān)疾病的關(guān)系開拓了新途徑，是近年來研討的熱點(diǎn)。腸道微生物中關(guān)鍵功用菌更是有能夠成為疾病診治的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。此外，病毒宏基因組測(cè)序直接以環(huán)境中一切病毒的遺傳物質(zhì)為研討對(duì)象，可快速鑒定一切病毒組成，在對(duì)已知或未知病毒病原體的及時(shí)發(fā)現(xiàn)和靜態(tài)監(jiān)測(cè)等方面具有突出優(yōu)勢(shì)，對(duì)病毒感染性疾病的防治有 重要意義。NGS因其測(cè)得數(shù)據(jù)量大、本錢低、速度快的特點(diǎn)，無疑將成為研討腸道微生物和宏基因組學(xué)的有力工具。

NGS 在運(yùn)用中面臨的應(yīng)戰(zhàn)

目前，NGS 技術(shù)慣例運(yùn)用于臨床病原學(xué)檢測(cè)仍存在很多實(shí)踐效果:

• 病原體鑒定的準(zhǔn)確度很大水平取決于剖析的參考數(shù)據(jù)庫的范圍和完整性;
• 臨床標(biāo)本的復(fù)雜性，能夠使病原體信息太少而招致數(shù)據(jù)喪失或病原體數(shù)據(jù)混雜在正常菌群中難以區(qū)分;
• NGS測(cè)序數(shù)據(jù)的解讀至關(guān)重要，測(cè)序的長度、數(shù)量、質(zhì)以及試劑能夠的細(xì)菌污染，均可影響病原體識(shí)別，招致標(biāo)本中細(xì)菌多樣性估量過高;
• 目前尚未樹立不同標(biāo)本測(cè)序前處置和參數(shù)設(shè)置的一致規(guī)則，微生物 NGS測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià)、質(zhì)量控制體系亦尚在樹立中。

中國基因檢測(cè)行業(yè)市場快速開展，增長速度遠(yuǎn)超全球水平，未來市場空間龐大，估量2020年將增長至378.8億元人民幣。我國作為人口大國，基因檢測(cè)行業(yè)已成為國度“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”戰(zhàn)略規(guī)劃的重要組成局部，開展前景寬廣，而病原微生物基因檢測(cè)的市場有愈加寬廣的空間值得我們?nèi)ラ_拓。

參考來源：

1. 新一代測(cè)序技術(shù)在臨床微生物檢測(cè)中的運(yùn)用

2. 感染性疾病病原學(xué)診斷新技術(shù)與臨床運(yùn)用戰(zhàn)略

3. 宏基因組測(cè)序在感染性疾病病原體檢測(cè)中的運(yùn)用