1. 該模型鑒定和評(píng)價(jià)的技術(shù)方法和指標(biāo)體系，符合潰瘍性結(jié)腸炎的病理特點(diǎn)，尤其與潰瘍性結(jié)腸炎反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的臨床特點(diǎn)高度相似。

（1） 疾病活動(dòng)指數(shù)

（2） 結(jié)腸指數(shù)

（3） 結(jié)腸組織大體評(píng)分

（4） HE 染色病理觀察

（5） MPO 酶活性檢測(cè)

2. 與國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有模型的異同

現(xiàn)有的潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法有單一化學(xué)法刺激、免疫法、免疫復(fù)合法、基因修飾法。雖然現(xiàn)在建造UC動(dòng)物模型的方法多種多樣，但是依舊存在著或多或少的缺陷。理想模型要簡(jiǎn)單易操作，同時(shí)盡可能全面、準(zhǔn)確的模擬人類(lèi)UC的病理生理學(xué)特點(diǎn)和表現(xiàn)，既要與自發(fā)的炎癥誘因相近，又要符合腸道炎癥進(jìn)展、組織損傷進(jìn)展等，同時(shí)模型病變盡量維持較長(zhǎng)時(shí)間，能盡量反映慢性病變的過(guò)程和特點(diǎn)，以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需求。而目前尚缺乏能滿(mǎn)足這些要求的模型，且已有模型以急性損傷模型為主。故亟待尋找更好的，具有良好重復(fù)性、穩(wěn)定性，并且操作簡(jiǎn)單的動(dòng)物模型，從而為研究UC發(fā)病機(jī)制、研發(fā)治療新藥物提供良好的基礎(chǔ)。

3. 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)或技術(shù)關(guān)鍵

3.1 創(chuàng)新點(diǎn)

本模型采用誘導(dǎo)劑聯(lián)用的方法，建立慢性、炎癥維持時(shí)間長(zhǎng)且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 造模方法。該模型改進(jìn)了傳統(tǒng)潰瘍性結(jié)腸炎模型的病程短、穩(wěn)定性差、模型指標(biāo)缺少特異性等問(wèn)題，更大程度的模擬了臨床慢性潰瘍性結(jié)腸炎病理指標(biāo)。

3.2 關(guān)鍵技術(shù)

采用噁唑酮和2,4,6-三硝基苯磺酸兩種誘導(dǎo)劑聯(lián)用、致敏與感染相結(jié)合的方法，建立了新慢性、炎癥維持時(shí)間長(zhǎng)且病程穩(wěn)定的小鼠慢性 UC 模型方法。

4. 可行性分析

4.1 前期摸索研究充分，通過(guò)閱讀大量中外文獻(xiàn)，較充分的了解潰瘍性結(jié)腸炎疾病以及模型建立過(guò)程中的問(wèn)題。

4.2 實(shí)驗(yàn)單位具備動(dòng)物飼養(yǎng)許可證以及較先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)器材和檢測(cè)設(shè)備。

4.3 通過(guò)閱讀大量中外文獻(xiàn)和走訪調(diào)研，噁唑酮和三硝基苯磺酸在臨床上應(yīng)用廣泛，效果明顯，具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)采用昆明種6-8周齡的健康成年小鼠，體重均在33±2g，SPF級(jí)。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購(gòu)自北京斯貝福生物科技股份有限公司，動(dòng)物用水為實(shí)驗(yàn)室制UP水經(jīng)過(guò)除菌處理。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均于具有檢驗(yàn)合格資質(zhì)的SPF級(jí)屏障動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入屏障實(shí)驗(yàn)室，觀察室適應(yīng)7天后無(wú)異常情況，方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)中小鼠均引頸處死，盡量減少動(dòng)物手術(shù)創(chuàng)傷程度及失血量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對(duì)環(huán)境和生態(tài)影響等符合國(guó)家相關(guān)法律規(guī)定。

1. 一般情況的觀察

2mg/kg 劑量組腹腔注射MPTP[2mg/(kg·d)]后，其中有2只樹(shù)鼩先后出現(xiàn)了一過(guò)性、暫時(shí)性的急性帕金森綜合征癥狀(如:行動(dòng)緩慢，反映遲鈍，四肢無(wú)力，步態(tài)不穩(wěn)，不能站立)，2只樹(shù)鼩之間表現(xiàn)強(qiáng)弱略有細(xì)微差異，均在每天給藥后持續(xù)約5 min左右，之后恢復(fù)正常。但上述帕金森癥狀是只有在腹44中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志2018年3月第28卷第3期 Chin J Comp Med，March 2018，Vol．28．No．3腔注射MPTP之后才會(huì)出現(xiàn)的急性癥狀，而且此癥狀持續(xù)一周之后就不再出現(xiàn)。其它指標(biāo)和其它樹(shù)鼩相同，即腹腔注射后至第3周末，精神狀態(tài)、毛色、排糞尿正常，但食欲下降，活動(dòng)量減少，第4周開(kāi)始對(duì)照組逐漸恢復(fù)正常，模型組依舊活動(dòng)量少，食欲明顯下降，毛皮蓬松沒(méi)有光澤，排糞時(shí)好時(shí)壞，部分

樹(shù)鼩糞便呈黑色。

2. 樹(shù)鼩體重變化情況

每周稱(chēng)量體重一次發(fā)現(xiàn)，1mg/kg劑量組和2mg/kg劑量組從開(kāi)始至第8周體重均出現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì);對(duì)照組從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到第4周出現(xiàn)體重下降，第4開(kāi)始逐漸上升直至恢復(fù)，如圖1所示。

3. 樹(shù)鼩腦脊液中多巴胺含量檢測(cè)結(jié)果

多巴胺含量檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組樹(shù)鼩腦脊液多巴胺含量均比對(duì)照組樹(shù)鼩的多巴胺含量明顯減少(P＜0.05);1mg/kg劑量組和2mg/kg劑量組比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。提示注射MPTP能選擇性破壞樹(shù)鼩中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，使樹(shù)鼩腦脊液中多巴胺含量明顯降低。(見(jiàn)表1)

4. 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2mg/kg、1mg/kg劑量組肉眼均可見(jiàn)樹(shù)鼩胃腸外形大小、顏色正常;也可觀察到胃腸道表面布滿(mǎn)淤血，內(nèi)容物呈黑色。體視鏡下兩組均有不同程度的胃腸黏膜損傷，具體表現(xiàn)為，胃黏膜局部充血或有彌漫性出血點(diǎn)，內(nèi)壁上多處紅腫出血，覆蓋白色苔狀物(如圖2B)，或胃黏膜部分輕微脫落，多處呈異樣粉紅色，內(nèi)壁上有零星散在輕微出血點(diǎn)(如圖2C)，胃竇與十二指腸則表現(xiàn)為正常無(wú)異樣狀況;也有十二指腸黏膜顏色略微加深，覆蓋白色苔狀物，壁上多處紅腫出血，或有散在出血點(diǎn)(如圖2D)。但兩組在胃腸黏膜損傷程度上沒(méi)有明顯區(qū)別;對(duì)照組肉眼和體視鏡下觀察，4只樹(shù)鼩胃、十二指腸均無(wú)異常表現(xiàn)，胃內(nèi)容物少，胃腸黏膜完整清潔，結(jié)構(gòu)完整，大小、形態(tài)、顏色均正常。結(jié)果見(jiàn)圖2。

注:A:對(duì)照組胃內(nèi)壁;B、C:實(shí)驗(yàn)組胃內(nèi)壁;D:實(shí)驗(yàn)組十二指腸。

5. HE 染色結(jié)果

2mg/kg和1mg/kg劑量組大部分樹(shù)鼩鏡下見(jiàn)正常胃壁黏膜;胃體黏膜可見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤(rùn)，部分表層黏膜脫落，少部分樹(shù)鼩可見(jiàn)胃黏膜損傷明顯，突出表現(xiàn)為黏膜下細(xì)胞水腫，部分胃黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，伴隨有出血、脫落的壞死黏膜，或有粘膜上皮脫落，固有層充血，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增多，粘膜下層充血水腫并有炎性細(xì)胞滲出，肌纖維間有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖3B);胃竇部胃小凹粘膜上皮脫離，固有層出血，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胃腺杯狀細(xì)胞增多，少許樹(shù)鼩腸腺上皮細(xì)胞發(fā)生化生，粘膜下層充血，有炎性細(xì)胞滲出，肌層細(xì)胞發(fā)生變性壞死(如圖3C);十二指腸粘膜上皮脫落，固有層充血，粘膜的杯狀細(xì)胞增多，部分區(qū)域出現(xiàn)了炎細(xì)胞的慢性炎癥改變，少許樹(shù)鼩有固有層和粘膜下層的結(jié)締組織增生，有多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖3D)，兩組比較無(wú)明顯區(qū)別。對(duì)照組樹(shù)鼩胃腸主細(xì)胞、壁細(xì)胞形態(tài)正常，胃壁漿膜層、肌層、黏膜下層、黏膜層四層結(jié)構(gòu)清晰完整，黏膜層腺體排列整齊。見(jiàn)圖 3。

注:A:對(duì)照組胃體;B:實(shí)驗(yàn)組胃體;C:實(shí)驗(yàn)組胃竇;D:實(shí)驗(yàn)組十二指腸。

1. 誘導(dǎo)劑準(zhǔn)備

MPTP溶于生理鹽水。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)雄性樹(shù)鼩。

3. 給藥

造模組和生理鹽水對(duì)照組。造模組腹腔給與不同劑量的 MPTP溶液造模。成年健康雄性樹(shù)鼩 12 只,隨機(jī)分為 3 組，每組 4 只，分別為 2mg/kg 劑量組、1 mg/kg 劑量組和對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù) 56 d。

4. 模型分析指標(biāo)

（1） 腦脊液中胺(dopamine)含量測(cè)定

56d后，采用1%戊巴比妥鈉溶液按每100 g體重0.2 mL 劑量對(duì)樹(shù)鼩腹腔注射麻醉，待樹(shù)鼩麻醉后采集腦脊液，用液相色譜儀測(cè)量腦脊液中多巴胺(dopamine)含量。

胃腸黏膜損傷導(dǎo)致的胃腸疾病是一種臨床上常見(jiàn)的急、慢性消化系統(tǒng)疾病，常反復(fù)發(fā)作，給患者的身心健康帶來(lái)極大的危害，建立理想的胃腸黏膜損傷性消化道動(dòng)物模型，對(duì)探索該病的病因、發(fā)病機(jī)制、病變發(fā)展規(guī)律，明確治療方法及研發(fā)新藥均有積極意義。目前報(bào)道的胃腸黏膜損傷動(dòng)物模型造模方法主要有:應(yīng)激性造模、藥物造模、乙酸或乙醇致胃潰瘍模型等。早期有研究者采用能選擇性破壞中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的毒性物質(zhì) 1-甲基-4-苯基-l，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)，腹腔注射大鼠后導(dǎo)致其胃、十二指腸黏膜損傷和潰瘍。