滾筒式睡眠干擾法可模擬睡眠剝奪致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，在物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)等認(rèn)知行為學(xué)檢測中均有體現(xiàn)。物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)是基于嚙齒類動(dòng)物先天對新物體更加具有探索傾向性的原理而建立, 它無需對動(dòng)物進(jìn)行任何刺激, 使其在自由狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí), 更加貼近人類的學(xué)習(xí)記憶行為, 用于評價(jià)動(dòng)物的短時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力。作為其中一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ降奈矬w位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)則主要用于反應(yīng)動(dòng)物的短時(shí)、空間記憶能力，而新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)則主要反映動(dòng)物的短時(shí)、非空間學(xué)習(xí)記憶能力。采用本造模方法可使小鼠在物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的相對辨別指數(shù)顯著下降，說明模型小鼠的短時(shí)、空間記憶能力受損。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型小鼠在測試期的相對辨別指數(shù)明顯下降，表明睡眠干擾可破壞小鼠的短時(shí)、非空間記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)則是一種經(jīng)典的海馬依賴性認(rèn)知行為檢測方法, 被廣泛用于空間認(rèn)知能力的評價(jià), 主要包括定位航行、空間探索、工作記憶等模式, 能反應(yīng)長時(shí)、空間參考記憶能力。經(jīng)過睡眠干擾14天后小鼠在水迷宮定位航行中的學(xué)習(xí)能力有所下降，表現(xiàn)為從第3天開始連續(xù)3天的尋臺(tái)潛伏期均顯著延長，而且在空間探索階段中的穿臺(tái)次數(shù)明顯減少，表明模型小鼠的空間參考記憶能力顯著下降。以上行為學(xué)分析結(jié)果顯示，滾筒式睡眠干擾儀可誘導(dǎo)小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

睡眠干擾被認(rèn)為會(huì)引起一些腦區(qū)的氧化應(yīng)激反應(yīng), 進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷, 引起學(xué)習(xí)記憶障礙。大量的活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生能通過酶失活、脂質(zhì)過氧化、DNA修飾等一系列變化造成神經(jīng)元損傷, 進(jìn)而最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。機(jī)體為了防御這種應(yīng)激損傷, 建立了一套完整的抗氧化酶防御自由基損傷系統(tǒng), 如抗氧化酶SOD、GPX、過氧化物酶（catalase,CAT）和非酶類抗氧化物GSH等。總抗氧化能力（T-AOC）可以用來反應(yīng)氧化應(yīng)激水平, 而MDA則是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物, 被廣泛認(rèn)為是ROS引起損傷的生物標(biāo)志物之一。鑒于腦內(nèi)的皮層和海馬在維持正常認(rèn)知功能中的重要作用, 我們首先對小鼠該兩個(gè)腦區(qū)內(nèi)的T-AOC、SOD、MDA和GSH這四種氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的水平進(jìn)行考察, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過睡眠干擾14天后模型小鼠皮層和海馬內(nèi)的T-AOC、SOD和GSH活性均不同程度的顯著下降, 而MDA水平則明顯升高, 即模型小鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高。除氧化應(yīng)激之外, 近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)睡眠干擾導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙與引起機(jī)體炎性反應(yīng)。睡眠干擾可顯著升高促炎細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的水平, 炎性反應(yīng)同樣是神經(jīng)退行性疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于1-對滾筒內(nèi)的動(dòng)物頻繁取出放回需要技巧，以保證可均衡性取出動(dòng)物用于檢測，從而避免動(dòng)物長時(shí)間脫離睡眠干擾狀態(tài)，產(chǎn)生功能性恢復(fù)；2-與其他應(yīng)激方式不同，滾筒式睡眠干擾通過物理性剝奪動(dòng)物的睡眠，模擬睡眠障礙效應(yīng)，除整體動(dòng)物行為學(xué)檢測之外，可進(jìn)一步結(jié)合電生理、組織病理學(xué)等深入探討睡眠干擾對抑郁、焦慮、運(yùn)動(dòng)功能等影響，為全面防護(hù)睡眠干擾所致功能性損傷提供技術(shù)和模型儲(chǔ)備。

本實(shí)驗(yàn)采用健康成年SPF級小鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物用水均經(jīng)過除菌處理。飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均于具有檢驗(yàn)合格資質(zhì)的SPF級屏障動(dòng)物室內(nèi)進(jìn)行，并且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以完整的包裝直接進(jìn)入屏障實(shí)驗(yàn)室，觀察適應(yīng)7天后無異常情況，方進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1材料

（1）試劑：小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析測試盒、小鼠白細(xì)胞介素6（IL-6）酶聯(lián)免疫分析測試盒和小鼠白細(xì)胞介素IL- 1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫分析測試盒（R&D公司，USA），小鼠總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒和還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國江蘇）

（2）儀器：

①行為學(xué)檢測：小鼠空場實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)、物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)檢測裝置、小鼠Morris水迷宮實(shí)時(shí)在線檢測分析系統(tǒng)

②氧化應(yīng)激、炎性因子相關(guān)指標(biāo)檢測：電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）、電熱溫培養(yǎng)箱（上海科學(xué)儀器有限公司）、低溫高速離心機(jī)、移液槍（德國Eppendorf公司）、全自動(dòng)波長多功能酶標(biāo)儀（瑞士 Tecan 公司）。

2評價(jià)方法

（1）行為學(xué)評價(jià):

①空場實(shí)驗(yàn)

空場實(shí)驗(yàn)發(fā)生于小鼠多功能空場實(shí)時(shí)檢測裝置內(nèi), 用于檢測動(dòng)物的自主活動(dòng)情況。該儀器由4個(gè)（30 cm × 28 cm × 35 cm）箱體組成,每個(gè)箱子上方有 120 Lux 的光源, 并有攝像頭對動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行監(jiān)測。檢測當(dāng)天取出對照組和睡眠干擾儀內(nèi)模型組小鼠后, 將小鼠置于空場測試箱的中央, 先適應(yīng)3 min, 隨后系統(tǒng)實(shí)時(shí)在線軟件自動(dòng)記錄接下來10 min內(nèi)小鼠的總路程和平均速度, 作為評價(jià)自主活動(dòng)的指標(biāo)。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 用75% 酒精擦洗箱體底板, 避免氣味對動(dòng)物產(chǎn)生影響。

② 物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)

物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)用于評價(jià)動(dòng)物的短時(shí)空間記憶能力, 發(fā)生于物體認(rèn)知檢測裝置。該裝置由4個(gè)黑色聚酯塑料材質(zhì)構(gòu)成的封閉箱（60 cm × 40 cm × 80 cm）構(gòu)成, 箱體左右兩側(cè)各有兩排LED燈條照明, 頂部采用攝像頭觀察動(dòng)物的活動(dòng)情況及探索過程。箱體內(nèi)部使用黑色PVC材料, 箱底板噴以黑色啞光漆并用砂紙打磨以避免反光, 底板可抽出便于清洗動(dòng)物殘屑物。

實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)階段：適應(yīng)期、熟悉期和測試期。適應(yīng)期為期3天,將動(dòng)物背對箱體依次放入實(shí)驗(yàn)箱中部位置使之自由活動(dòng), 10 min/只/d, 1 次/d。適應(yīng)結(jié)束后, 次日進(jìn)行熟悉期和測試期。熟悉期時(shí), 將兩個(gè)完全相同的物體放入實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)相鄰的磁鐵處固定, 記錄小鼠5 min內(nèi)對兩物體的探索行為, 比較動(dòng)物對熟悉物體A1和熟悉物體A2的探索時(shí)間來評價(jià)動(dòng)物對物體所在位置是否存在偏愛性, 用動(dòng)物對物體對的總探索時(shí)間來評價(jià)動(dòng)物對兩物體的總探索能力是否處于同一水平。間隔30 min后開始測試期, 將其中一個(gè)熟悉物體改變位置, 移動(dòng)至新的位置。記錄小鼠在5 min的測試期內(nèi)分別對變化位置后物體（“新物體”）（TN）和原熟悉物體的探索時(shí)間（TF）, 用相對辨別指數(shù)（discrimination index, DI）來評價(jià)動(dòng)物的記憶能力。相對辨別指數(shù)計(jì)算公式為DI =(TN-TF)/(TN+TF)。

③ 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)生于物體識(shí)別系統(tǒng)內(nèi), 實(shí)驗(yàn)流程同樣包括3個(gè)階段: 適應(yīng)期（10 min/d, 連續(xù)3d）;熟悉期（5 min）和測試期（5 min）。其中適應(yīng)期和熟悉期的實(shí)驗(yàn)步驟同物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)一樣, 只是測試期時(shí)有所不同: 在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)的測試期, 將其中一個(gè)熟悉物體變換為新物體, 另一熟悉物體保持不變。記錄小鼠在測試期內(nèi)分別對新穎物體（TN）和原熟悉物體（TF）的探索時(shí)間, 識(shí)別能力同樣用相對辨別指數(shù)（DI）來表示。其反應(yīng)的是動(dòng)物的短時(shí)、非空間記憶能力。

④Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典的評價(jià)動(dòng)物空間參考記憶能力的認(rèn)知行為檢測方法。本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)時(shí)在線檢測系統(tǒng)由一個(gè)不銹鋼噴塑圓柱形水池和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分組成。水池直徑為100 cm,高38 cm, 并且水溫維持在23 ± 2 °C。加入墨汁使之渾濁，水池被平均劃分為4個(gè)象限, 軟件記錄為1,2,3,4四個(gè)象限。一圓柱形平臺(tái)（直徑6 cm, 高15 cm）被置于低于水面1 cm 的其中一象限內(nèi), 上方安裝有攝像頭用于監(jiān)控動(dòng)物游泳情況。

實(shí)驗(yàn)分為定位航行階段（5 d）和空間探索階段(1 d)。首先開始為期5天的定航訓(xùn)練, 開始前先將動(dòng)物放在平臺(tái)上適應(yīng)10 s, 然后隨機(jī)選取1個(gè)入水點(diǎn), 將動(dòng)物放入水中, 給予90 s 尋求平臺(tái), 若成功找到平臺(tái)則讓其在平臺(tái)上停留10 s再歸籠, 若未找到平臺(tái)則引導(dǎo)動(dòng)物至平臺(tái), 停留10 s。每天每只動(dòng)物訓(xùn)練2次, 系統(tǒng)自動(dòng)記錄動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間（尋臺(tái)潛伏期）作為評價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。于第6天,撤去平臺(tái), 以目標(biāo)象限的對角象限中點(diǎn)為入水點(diǎn), 將動(dòng)物面向池壁放入水中, 檢測 90 s, 記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限的穿臺(tái)次數(shù)作為評價(jià)指標(biāo),用來檢測動(dòng)物對平臺(tái)空間位置的準(zhǔn)確記憶, 即記憶保持能力。

（2）氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

分別將小鼠的皮層和海馬組織與冷生理鹽水超聲混合（1: 9）, 然后將混勻液于3500 rpm（10 min, 4 °C）離心, 取上清液用于生化檢測。按照南京建成生物工程研究所的T-AOC, SOD, MDA和 GSH生化試劑盒說明書步驟分別檢測皮層和海馬內(nèi)的T-AOC, SOD活性和MDA和 GSH的含量。

（3）血清內(nèi)促炎因子檢測

血清內(nèi)促炎因子TNF-α, IL-6和IL-1β的含量測定按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

3評價(jià)結(jié)果

（1）行為學(xué)結(jié)果：

①空場實(shí)驗(yàn)

睡眠干擾對小鼠自主活動(dòng)的影響注：A總路程(cm)；B平均速度(cm/s)。② 物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn) 熟悉期結(jié)果如圖3（A）和（B）所示, 睡眠干擾14天未對小鼠的探索能力產(chǎn)生影響, 且各組小鼠對兩熟悉物體的探索時(shí)間亦未見差異, 表明所有動(dòng)物對兩熟悉物體無偏愛性。在測試期,睡眠干擾14天后小鼠的物體位置識(shí)別能力明顯下降（P<0.05），表明小鼠的短時(shí)、空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。

③ 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

④Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

在定位航行階段, 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加,各組動(dòng)物的尋臺(tái)潛伏期逐漸縮短, 而與對照組相比, 睡眠干擾模型組從第3天至第5天的潛伏期均顯著性增加（P<0.05）, 表明睡眠干擾14天能損害小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力, 使得模型動(dòng)物的認(rèn)知功能受損。探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5B）表明, 睡眠干擾模型組的穿臺(tái)次數(shù)明顯減少（P<0.05），表明其對空間參考記憶亦有改善作用。

（2）氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

睡眠干擾14天后模型小鼠皮層和海馬內(nèi)的氧化應(yīng)激水平顯著升高, 表現(xiàn)為T-AOC和SOD活性顯著性下降, 而MDA水平則明顯升高, 且GSH含量明顯減少（P<0.05,P<0.01 or P<0.001），結(jié)果表明睡眠干擾引起腦內(nèi)持續(xù)性氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因之一。

注：A皮層和海馬內(nèi)T-AOC活性；B皮層和海馬內(nèi)SOD活性；C皮層和海馬內(nèi)MDA水平；D皮層和海馬內(nèi)GSH含量。與對照組相比，#P<0.05， ##P<0.01，###P<0.001.

（3）炎性因子指標(biāo)檢測

對血清內(nèi)促炎細(xì)胞因子（TNF-α, IL-6 and IL-1β）的含量進(jìn)行測定, 結(jié)果如圖7所示, 模型組小鼠血清內(nèi)以上三種促炎細(xì)胞因子的含量均呈極顯著性增加（P<0.001），表明睡眠干擾激活小鼠機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)，持續(xù)性炎性細(xì)胞因子釋放可能是誘發(fā)小鼠學(xué)習(xí)記憶水平下降的另一原因。

注：A TNF-α水平；B IL-6水平；C IL-1β水平。與對照組相比，###P<0.001.

1 動(dòng)物：SPF級，ICR小鼠（4周齡；20±2g），雄性

2 儀器：滾筒式睡眠干擾儀(由中國航天員科研訓(xùn)練中心、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所和北京鑫海華儀科技有限公司聯(lián)合研制)

3實(shí)驗(yàn)環(huán)境：隔音并且穩(wěn)定的SPF級動(dòng)物房和睡眠干擾室環(huán)境（溫度：23-25℃，濕度：55%。12h/12h明暗周期）。動(dòng)物購進(jìn)后，在動(dòng)物房適應(yīng)7天后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

4模型誘導(dǎo)方法：睡眠干擾采用滾筒式睡眠干擾儀裝置進(jìn)行，造模方法如下：首先進(jìn)行為期3天的睡眠干擾適應(yīng)期，（1）將睡眠干擾儀一側(cè)滾筒壁打開，把特定水瓶裝滿動(dòng)物飲用水后，與食物一起放入睡眠干擾儀食盒，再將睡眠干擾組小鼠放入儀器中，一組小鼠放入睡眠干擾儀的一個(gè)室，關(guān)閉打開的滾筒壁。（2）設(shè)置儀器參數(shù)，參數(shù)如下：轉(zhuǎn)速60s/圈，轉(zhuǎn)圈1圈，休息時(shí)間2m。設(shè)置完成后，選擇“開始”，按“ENT”鍵開始實(shí)驗(yàn)。（3）每天適應(yīng)3小時(shí)（8-11AM），適應(yīng)時(shí)間到3小時(shí)，選擇“結(jié)束”，按“ENT”鍵停止實(shí)驗(yàn)，打開滾筒壁取出動(dòng)物，放回動(dòng)物房，連續(xù)適應(yīng)3天。隨后進(jìn)行模型建立：將睡眠干擾組小鼠按上述步驟放入睡眠干擾儀，設(shè)置儀器參數(shù)，進(jìn)行連續(xù)睡眠干擾14天。每天定期選擇“結(jié)束”，按“ENT”鍵停止實(shí)驗(yàn)，打開滾筒壁，打開食盒加食加水，然后關(guān)閉食盒，關(guān)閉打開的滾筒壁，選擇“開始”，按“ENT”鍵開始實(shí)驗(yàn)。睡眠干擾第14天開始進(jìn)行認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測。檢測開始前，取出動(dòng)物，放到相應(yīng)的檢測室進(jìn)行檢測，在行為學(xué)檢測時(shí)應(yīng)盡量減少動(dòng)物的非干擾時(shí)間，檢測完后及時(shí)放回滾筒內(nèi)繼續(xù)干擾。

圖1 滾筒式睡眠干擾儀圖（國家發(fā)明專利授權(quán)號：201210356645.X）

隨著現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展，生活節(jié)奏加快、工作壓力大、生活方式不健康等因素導(dǎo)致很大一部分群體長期處于慢性睡眠干擾的狀態(tài)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，睡眠障礙是當(dāng)今世界一個(gè)應(yīng)該得到重視和解決的公共衛(wèi)生現(xiàn)狀問題。目前睡眠障礙率達(dá)27%，而我國存在睡眠問題人口率則高達(dá)38.2%，甚至高于世界平均水平，即平均每四人中就有一人存在睡眠障礙問題。此外，航空、航天、航海等軍事特因環(huán)境下，由于晝夜生物節(jié)律顛倒，睡眠周期紊亂，睡眠不足或睡眠障礙，造成作業(yè)人員機(jī)體免疫力、作業(yè)能力、警覺性和判斷力降低，影響作業(yè)任務(wù)的完成，嚴(yán)重者危及生命。現(xiàn)代研究表明，睡眠是個(gè)體生存發(fā)育所必需的一項(xiàng)重要生理活動(dòng), 其對機(jī)體的能量平衡、免疫機(jī)能、學(xué)習(xí)的形成及維持記憶等起到關(guān)鍵作用[2, 3]，一旦睡眠障礙/干擾會(huì)引起情緒、認(rèn)知功能以及免疫功能等一系列的改變, 伴隨疲勞的增加, 可引起生理、心理甚至行為的變化[4, 5]。睡眠干擾(Sleep Interruption，SI)是指由于環(huán)境或自身原因無法滿足正常睡眠的情況，一般指在24小時(shí)中的睡眠小于4小時(shí)。睡眠干擾可以分為部分睡眠干擾（partialsleep interruption, PSI）和完全睡眠干擾（total sleep interruption, TSI）。TSI指24h之內(nèi)完全無睡眠；PSI一般指24h之內(nèi)睡眠量通常達(dá)不到4h。研究已證實(shí)無論是部分睡眠干擾或是完全睡眠干擾均會(huì)對學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生損害[6]，此外睡眠干擾與諸如阿爾茨海默病、帕金森氏病、腦血管疾病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病高度相關(guān)[7, 8]。針對睡眠干擾的諸多危害和缺乏有效對抗手段的現(xiàn)狀，臨床前研究選擇合適的動(dòng)物模型模擬睡眠干擾產(chǎn)生的效應(yīng)對于解釋睡眠干擾所致學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制并尋求特異防護(hù)手段意義重大。

目前睡眠干擾方法分為兩類：化學(xué)誘導(dǎo)法和物理因素干擾法。其中化學(xué)誘導(dǎo)法多采用對動(dòng)物進(jìn)行注射中樞興奮類化學(xué)藥物（如咖啡因、去氧麻黃堿、神經(jīng)毒素(DSP-4)、可樂定等）部分或全部剝奪睡眠，該類方法由于存在動(dòng)物個(gè)體差異較大、不易掌握等問題而應(yīng)用較少。物理因素誘導(dǎo)睡眠干擾方法主要包括小平臺(tái)水環(huán)境、滾筒、水平轉(zhuǎn)盤、跑臺(tái)、人工輕觸刺激等。由于小平臺(tái)水環(huán)境法因頻繁落水造成物溺水死亡率高、人工輕觸刺激需要消耗實(shí)驗(yàn)人員的體力而較少應(yīng)用。目前應(yīng)用較多的滾筒、水平轉(zhuǎn)盤和跑臺(tái)等。本模型采用滾筒式對小鼠進(jìn)行睡眠干擾建立穩(wěn)定的學(xué)習(xí)記憶障礙模型。

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