動物模型的制備和應用實驗必須在具備相應資質的實驗室開展。動物模型的制備、應用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應符合國家相關法律規(guī)定。

1．中性粒細胞的形態(tài)及生化特征

原始中性粒細胞的發(fā)育首先由髓系祖細胞經譜系決定，發(fā)育成粒細胞前體細胞，再由粒細胞前體細胞經過增殖，分化和成熟形成有功能的中性粒細胞。在斑馬魚中，區(qū)分中性粒細胞可通過以下形態(tài)學與細胞學方法[1,2]：（1）成熟的中性粒細胞最顯著的形態(tài)學特征為含有分葉核以及大量顆粒的細胞質，可以在循環(huán)系統(tǒng)以及結締組織中被很清晰地辨認。（2）還可以通過分子標記來分辨不同成熟時期的中性粒細胞。已經有研究報道的粒細胞特異分子標記有轉錄因子C/ebp1，粒細胞顆粒中含有的髓過氧化物酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還可通過檢測細胞的激活、趨化、變形運動能力、及吞噬、殺菌作用來辨別。（4）此外中性粒細胞可被蘇丹黑B（Sudanblack B，SB）特異性染色，并且可根據(jù)染色程度來辨別不同分化過程的中性粒細胞。

2．中性粒細胞與病原菌感染

中性粒細胞是一種具有多形核的白細胞，是人體固有免疫中的重要組成成分，在機體抵抗病原菌感染時起著重要的作用。中性粒細胞在體內含量豐富，大約占人體白細胞總數(shù)的40%-75%[3]，并且在機體遭受病原菌感染時，中性粒細胞能夠迅速的從血管中遷移到感染部位[4]。當中性粒細胞到達感染處后，主要通過兩種方式來抵抗感染，一種是分泌大量的細胞因子和趨化因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這些小分子能夠招募和激活更多的中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞到達感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細胞還能夠直接吞噬和消化病原菌，這主要依賴于斑馬魚中性粒細胞中含有豐富的顆粒酶。中性粒細胞內含有多種顆粒，這些顆粒富含各種殺菌作用的蛋白，并且在終末分化完成之前各種富含不同組分的顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細胞中三種顆粒分別是（1）嗜天青顆粒：又稱初級顆粒，在早幼粒細胞中數(shù)量最多，顆粒中含有髓過氧化物酶、溶菌酶及較多的水解酶。（2）特異顆粒：又稱次級顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多種CD抗原和受體。（3）白明膠酶顆粒：含白明膠酶、溶菌酶[8]。這些顆粒主要通過兩種方式來殺滅病原菌。一種是氧依賴性殺菌途徑，主要通過激活膜結合成分NADPH系統(tǒng)，產生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）來直接氧化并殺死病原菌[9]；另一種方式是通過氧非依賴性方式來消化破壞病原菌的細胞膜或壁結構的完整性[10,11]，從而通過使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對這些顆粒酶的研究大多數(shù)是在體外實驗進行的，大部分顆粒酶的體內功能是未知的。因此了解和研究這些顆粒酶的成分以及顆粒酶的功能有助于研發(fā)新的抗菌酶。

圖1. 中性粒細胞中所含的顆粒酶種類，引用自Borregaard 等[12]。

3．斑馬魚Npsn蛋白的簡介

Npsn最早在鯉魚（Cyprinus carpio）的淋系造血組織中發(fā)現(xiàn)，屬于蝦紅素蛋白家族（astacinfamily）的一員，并且具有肽鏈內切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的一員，在蛋白質消化、個體背腹軸確定以及形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用[14]。研究者通過對比鯉魚的Npsn的蛋白序列與其他物種的同蛋白家族酶的相似性，發(fā)現(xiàn)Npsn與medaka的孵化酶有大于50%的序列相似性，但是作者并沒有在鯉魚的孵化液中檢測到Npsn的存在，所以作者猜測Npsn可能沒有孵化酶的活性。而關于Npsn的另一個研究是在斑馬魚中進行的，作者通過分析斑馬魚造血組織的ESTs序列以及整體原位雜交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實驗，發(fā)現(xiàn)了三個新的特異性表達在斑馬魚血管以及造血組織中的基因，Npsn就是其中的一個[15]。并且作者通過雙色原位雜交進一步發(fā)現(xiàn)Npsn可能表達在斑馬魚的中性粒細胞中。根據(jù)以上前人的研究，我們猜測，Npsn可能是斑馬魚中性粒細胞中的一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細胞中的作用，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚在作為研究中性粒細胞顆粒酶功能的模式生物中的優(yōu)越性

近幾十年來，斑馬魚逐漸成為一種強大的工具來研究感染類疾病，除了斑馬魚的傳統(tǒng)優(yōu)勢外，在研究中性粒細胞和病原菌的相互關系中具有獨特的優(yōu)勢。首先，斑馬魚中性粒細胞的發(fā)育過程是保守的，都是起源于造血干細胞，通過早幼粒、中幼粒最終發(fā)育成為成熟的帶有分頁核的粒細胞[12]。其次，斑馬魚中成熟的轉基因技術可以用熒光蛋白標記中性粒細胞，進而在活體實時觀察中性粒細胞對病原菌的響應以及吞噬病原菌的過程[16]。第三，利用微分干涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可以清晰看到中性粒細胞所含的顆粒酶，以及顆粒酶的發(fā)育過程。

參考文獻

[1] Le Guyader D,Redd MJ, Colucci-Guyon E, et al. Origins and unconventional behavior ofneutrophils in developing zebrafish[J]. Blood, 2008,111(1):132-41.

[2] Jin H, Li L, Xu J,et al. Runx1 regulates embryonic myeloid fate choice in zebrafish through anegative feedback loop inhibiting Pu.1 expression[J]. Blood,2012,119(22):5239-49.

[3] Witko-Sarsat V,Rieu P, Descamps-Latscha B, et al. Neutrophils: molecules, functions andpathophysiological aspects[J]. Lab Invest, 2000,80(5):617-53.

[4] Amulic B, CazaletC, Hayes GL, et al. Neutrophil function: from mechanisms to disease[J]. AnnuRev Immunol, 2012,30:459-89.

[5] Dinarello CA.Biologic basis for interleukin-1 in disease[J]. Blood, 1996,87(6):2095-147.

[6] Wawrocki S,Druszczynska M, Kowalewicz-Kulbat M, et al. Interleukin 18 (IL-18) as a targetfor immune intervention[J]. Acta Biochim Pol, 2016,63(1):59-63.

[7] Stephan A,Batinica M, Steiger J, et al. LL37:DNA complexes provide antimicrobial activityagainst intracellular bacteria in human macrophages[J]. Immunology,2016,148(4):420-32.

[8] Faurschou M,Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation[J].Microbes Infect, 2003,5(14):1317-27.

[9] Dinauer MC,Lekstrom-Himes JA, Dale DC. Inherited Neutrophil Disorders: Molecular Basis andNew Therapies[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2000:303-18.

[10] Spitznagel JK,Shafer WM. Neutrophil killing of bacteria by oxygen-independent mechanisms: ahistorical summary[J]. Rev Infect Dis, 1985,7(3):398-403.

[11] Shafer WM, KatzifS, Bowers S, et al. Tailoring an antibacterial peptide of human lysosomalcathepsin G to enhance its broad-spectrum action against antibiotic-resistantbacterial pathogens[J]. Curr Pharm Des, 2002,8(9):695-702.

[12] Borregaard N.Neutrophils, from marrow to microbes[J]. Immunity, 2010,33(5):657-70.

[13] Hung CH, Huang HR,Huang CJ, et al. Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zincendopeptidase of the astacin family[J]. J Biol Chem, 1997,272(21):13772-8.

[14] Sterchi EE,Stocker W, Bond JS. Meprins, membrane-bound and secreted astacinmetalloproteinases[J]. Mol Aspects Med, 2008,29(5):309-28.

[15] Song HD, Sun XJ,Deng M, et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidneymarrow[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16240-5.

[16] Tobin DM, May RC,Wheeler RT. Zebrafish: a see-through host and a fluorescent toolbox to probehost-pathogen interaction[J]. PLoS Pathog, 2012,8(1):e1002349.