DNMT1心肌特異性基因敲除SD大鼠模型
討論與結論
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
生物安全性
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
評價驗證
4.1 心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠模型的建立
利用Cre/loxP重組系統的原理，進行條件性敲除（Conditionalknockout，CKO），制備心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第三外顯子兩端插入兩個loxP位點來構建DNMT1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進行雜交，經兩輪雜交最終獲得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，通過PCR方法進行基因型鑒定心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠基因型（圖3）。免疫印跡Westernblot方法鑒定DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠DNMT1蛋白的敲除效率達65.8%（圖4）。
圖3 PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖
圖4 Western blot 檢測Dnmt1蛋白在心肌組織中的敲除效率
4.2 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠生存率觀察
在正常生理狀態下，Dnmt1于心肌組織內敲除，未見明顯異常。于是我們隨即用阿霉素對大鼠進行處理，觀察在面對病理刺激時，Dnmt1的缺失對心肌病理進程是否有影響。結果，WT-saline組，KO-saline組及KO-ADR組，直至觀察末期未見動物死亡，生存率為100%。而WT-ADR組生存率為75%,（圖5，WT-saline（n = 8）組與WT-ADR（n = 8）相比，P = 0.143）。與WT-ADR組相比，KO-ADR組增加了25%的生存率。Dnmt1敲除可增加經ADR藥物處理后的生存率。但無統計學意義。
圖5 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠生存率分析
4.3 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠心臟結構和功能分析
四組大鼠連續給予ADR藥物處理2周，給藥終點后觀察2周，觀察終點時各組大鼠進行超聲影像學觀察。結果顯示，WT-ADR組大鼠LVIDS（左心室收縮末期內徑，Leftventricular end-systolic diameter）增加了23.9%（圖6，n=6，P<0.05）；LVAWS（收縮期左心室前壁厚度，Leftventricular anterior wall; systolic）下降了16.8%（圖6，n=6，P<0.05）；FS%（短軸縮短率，Fractionalshortening）下降了19.3%（圖6，n=6，P<0.05）。
與WT-ADR大鼠相比，KO-ADR大鼠超聲參數指標改善顯著。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR組大鼠LVIDS增加了13.9%（圖6，n=6，P=0.224）；LVAWS下降了14.6%（圖6，n=6，P=0.053）；FS%下降了11.8%（圖6，n=6，P=0.223），但上述3個超聲參數均無顯著性差異（n=6，P>0.05）。
圖6 ADR藥物處理后大鼠超聲參數分析
4.4 ADR藥物處理后心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠心肌病理組織學觀察
Dnmt1敲除可以顯著改善ADR藥物處理后心臟在體形態和功能，隨后我們進一步分析藥物處理后，各組大鼠心肌顯微和超微水平病理組織學變化情況。
摘取大鼠心臟，稱取心臟濕重，計算HW/BW比值；制備心臟病理組織切片，H&E及Masson染色觀察大鼠心肌顯微水平病理組織變化；切取大鼠心肌組織，制備電鏡樣本，TEM觀察心肌超微水平組織學變化。
HW/BW比值結果顯示，WT-ADR組大鼠，HW/BW增加了14.9%（圖7，n=6，P<0.05）。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR組大鼠HW/BW增加了4.5%（圖7，n=6，P=0.384），無統計學差異。
圖7 ADR藥物處理后各組大鼠HW/BW比值分析
H&E及Masson染色結果顯示，WT-ADR組大鼠心臟整體增大，心室腔擴張，室壁變薄，心肌纖維排列不齊，心肌纖維出現斷裂，心肌纖維化程度顯著增加等現象。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR大鼠心臟整體擴張情況明顯改善，心肌纖維斷裂及纖維化程度改善明顯。TEM結果顯示，WT-saline組大鼠心肌纖維清晰可見，排列有序，心肌線粒體形態多呈橢圓形，排列整齊有序，雙層膜結構清楚，嵴結構致密。WT-ADR組大鼠，心肌纖維出現明顯斷裂溶解，肌節出現模糊不清，線粒體發生嵴斷裂，甚至空化，腫脹明顯（圖8）。與KO-saline組大鼠相比，KO-ADR大鼠心肌纖維斷裂溶解現象改善明顯，線粒體腫脹空化現象亦明顯改善。
圖 8 ADR藥物處理后各組大鼠心肌病理組織學觀察
制備方法
3.1 實驗材料
3.1.1 實驗動物
SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012-001】。實驗中涉及動物的操作程序已獲得中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ZLF18003.
3.1.2實驗儀器
3.1.3實驗試劑
3.1.4模型構建流程 利用Cre/loxP重組系統的原理，進行條件性敲除（Conditional knockout，CKO），制備心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第1外顯子兩端插入兩個loxP位點來構建DNMT1flox/+大鼠，使其與αMHC-Cre大鼠進行雜交，經兩輪雜交最終獲得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法進行基因型鑒定，使用Western blot技術進行敲除效率的鑒定。 3.1.5 DNMT1條件性敲除大鼠及心肌組織特異性Isca1敲除大鼠的建立 3.1.5.1 DNMT1條件性敲除大鼠模型的建立 (1) 設計方案
圖 1. DNMT1條件性敲除模型構建設計方案
(2) 構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expressionvector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。
靶點1:
GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG
R- DNMT1-gRNA UP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT
R- DNMT1-gRNA DOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC
靶點2:
AGCCCTGAACTCCTTATG TGG
R- DNMT1-gRNA UP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG
R- DNMT1-gRNA DOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT
(3) 合成的sgRNA單鏈通過退火復性結合成小片段，插入BSA I線性化的載體，構建完成的sgRNA載體通過體外轉錄成為可注射的sgRNA。
(4) 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通過體外轉錄成為可注射的Cas9-RNA。
(5) 顯微注射
1) 超數排卵：15只3-4周齡SD雌鼠注射激素進行超排。
2) 受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。
3) 雄鼠結扎：制作30只8周齡輸精管結扎的SD雄鼠。
4) 受體鼠制備：8-10周齡SD雌鼠與結扎的SD雄鼠交配后選取見栓的雌鼠。
5) 胚胎移植：將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，150枚卵，5只受體鼠）。
(6) 基因型鑒定
1) 剪尾編號：出生7-10天的乳鼠，剪取腳趾和尾尖進行編號及取材。
2) 基因組DNA提取：使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA
3) PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物并進行PCR檢測。
(7) 結果分析：選取通過PCR檢測后含有不同于野生型分子量條帶的鼠號，將PCR產物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。
(8) 根據測序結果確定Isca1條件性敲除模型大鼠（SD. DNMT1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后續實驗。
3.1.5.2 心肌組織特異性DNMT1敲除大鼠（DNMT1flox/flox/MHC-Cre）的建立
根據3.1.5.1獲得DNMT1flox/+大鼠F1代后，首先通過8周齡左右DNMT1flox/+與野生型大鼠進行雜交，獲得一定數量的DNMT1flox/+大鼠。與此同時使8周齡左右Isca1flox/+大鼠與αMHC-Cre大鼠（SD.Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）進行雜交，得到DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周齡左右DNMT1flox/+大鼠與DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠進行第二輪雜交，可得到DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌組織特異性Isca1敲除純合子大鼠，用于后續實驗。
圖 2. DNMT1 flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育3.1.5.3 鼠尾基因組DNA提取
在幼崽出生后剪腳趾標記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然后參照DNA提取試劑盒說明書按以下程序操作。
(1) 加入100μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。
(2) 12000rpm 離心5min，轉移上清于一無菌的離心管中。
(3) 加入500μLBB2，立即渦旋5s，室溫孵育10min。
(4) 將全部的溶液加入離心柱中，8000rpm離心1min，棄掉流出液。
(5) 加入500μL CB2溶液，12000 rpm離心1min，棄掉流出液。
(6) 重復步驟（5）一次。
(7) 加入500μL WB2（使用前加入88 mL無水乙醇），12000rpm 離心1min，棄掉流出液。
(8) 重復步驟（7）一次。
(9) 10000rpm 離心2min，徹底去除殘留的WB2。
(10) 將離心柱置于一干凈的離心管中，開蓋靜置5min，在柱的中央加入50~200μL預熱EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3min，12000rpm 離心2min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。
研究背景
一、疾病概述
心力衰竭，簡稱心衰，是指由于心臟收縮和（或）舒張功能障礙，無法將靜脈回心血量充分排出心臟，導致靜脈系統血液淤積，動脈系統灌注不足，從而引發心臟循環障礙癥候群，心衰并不是一個獨立的疾病，而是所有心血管疾病發展的終末階段。近年來，隨著我國社會老齡化和高血壓，冠心病等心血管疾病發病率的增加，使得心衰呈現高發病率，高致殘率和高死亡率的特點，《2018中國心力衰竭診斷和治療指南》中報道我國心衰患病率為0.9%，有1000萬左右的心衰患者。
幾乎所有的心血管疾病最終都會導致心衰的發生，而在基礎性心臟病的基礎上，一些因素亦可誘發心衰的發生，常見誘因包括，感染，嚴重心律失常，心臟負荷增大，藥物中毒（如洋地黃）等等。
心衰在臨床上可分為急性心衰和慢性心衰。臨床表現，包括呼吸困難，運動耐力下降，心室腔增大，心臟功能下降（LVEF<40-50%），心臟順應性降低，心室腔內淤血，肺循環及體循環淤血。
臨床檢查手段，包括超聲影像分析，心電圖，心衰標志物（B型利鈉肽（BNP），N末端B型利鈉肽原（NT-proBNP））心肌壞死標志物（心肌肌鈣蛋白T（cTnT）及心肌肌鈣蛋白I（cTnI））。
臨床治療方法，包括強心（米力農，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重構（卡維地洛）及心臟移植。
二、模型背景
1、實驗動物背景信息
SD大鼠
2、研究背景
心肌細胞的發育及病理發展進程是一個協調的多步驟過程，在不同階段具有其特征性基因表達譜，并受多種機制嚴格調控，如DNA甲基化。研究發現，DNA甲基化在包括心肌病及心衰在內的多種心血管疾病病理進程中發揮著重要作用，作為基因組最常見的修飾方式，啟動子區的甲基化，可導致穩定的基因沉默。
關于DNA甲基化轉移酶，其家族各成員的研究較多，但關于Dnmt1在心臟發生發展，特別是在心肌病和心衰病理進程中的作用仍不清楚。
我們課題組前期發現Dnmt1在心肌病動物模型心肌組織中表達增高，提示我們Dnmt1可能參與心臟發育及心肌病病理發展進程，所以通過將已建立的Dnmt1條件性敲除工具大鼠與心肌組織特異的Cre過表達工具大鼠進行雜交，從而獲得心肌組織特異性Dnmt1敲除大鼠模型，探究Dnmt1參與心臟發育及其參與心肌病及心衰病理進程的作用及可能的分子機制，明確Dnmt1的生物學作用，為心衰等心血管疾病的防治提供思路和研究方向。
參考文獻：
[1] MARON B J, TOWBIN J A, THIENE G, et al.Contemporary definitions and classification of the cardiomyopathies: anAmerican Heart Association Scientific Statement from the Council on ClinicalCardiology, Heart Failure and Transplantation Committee; Quality of Care andOutcomes Research and Function [J]. Circulation, 2006, 113(14): 1807.
[2] FATEMI M, HERMANN A, PRADHAN S, et al. Theactivity of the murine DNA methyltransferase Dnmt1 is controlled by interactionof the catalytic domain with the N-terminal part of the enzyme leading to anallosteric activation of the enzyme after binding to methylated DNA [J].Journal of Molecular Biology, 309(5): 0-1199.
[3] MARESCA A. Dna Methyltransferase 1 Mutationsand Mitochondrial Pathology: Is Mtdna Methylated? [J]. Frontiers in Genetics,2015, 6(90.
[4] JORGENSEN B G, BERENT R M, HA S E, et al. DNAmethylation, through Dnmt1, has an essential role in the development ofgastrointestinal smooth muscle cells and disease [J]. Cell Death & Disease,2018, 9(5): 474.
[5] MA, DUAN. Association between mRNA levels ofDnmt1, Dnmt3A, Dnmt3B, MBD2 and LINE-1 methylation status in infants withtetralogy of Fallot [J]. International Journal of Molecular Medicine, 32(3):694-702.
模型信息
中文名稱:DNMT1心肌特異性基因敲除SD大鼠模型
英文名稱:DNMT1 cardiac specific knockout SD rat model
類型:心力衰竭動物模型
分級:NA
用途:用于心力衰竭研究。
研制單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
保存單位:中國醫學科學院醫學實驗動物研究所
