Igfbp5基因敲除小鼠模型，采用的是基于CRISPR/Cas9技術(shù)的完全性基因敲除（Conventional Knockout,KO）。完全性基因敲除是把敲除目的基因的所有外顯子或幾個(gè)總要的外顯子功能區(qū)敲除掉，獲得全身所有的組織和細(xì)胞中都不表達(dá)該基因的小鼠模型。Armh4基因敲除小鼠模型為完全性基因敲除模型（KO），該模型應(yīng)用范圍廣，可以制造針對(duì)各類(lèi)疾病不同組織器官細(xì)胞的疾病模型。

CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其對(duì)基因進(jìn)行定位的精準(zhǔn)編輯，在向?qū)NA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的共同作用下，細(xì)胞基因組DNA（被看成外源DNA）將被準(zhǔn)確剪切。但是，被CRISPR/Cas9剪切需要滿足幾個(gè)條件。第一，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。第二，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)。

肺結(jié)核系一種發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)的呼吸系統(tǒng)疾病，大量研究表明IGFBP5與肺組織的發(fā)育、肺纖維化和肺癌緊密相關(guān)，然而，目前暫無(wú)相關(guān)研究探討IGFBP5在肺結(jié)核中的作用?？紤]到肺結(jié)核與肺癌的關(guān)系密切，因此探究IGFBP5在肺結(jié)核疾病中的潛在作用及分子機(jī)制至關(guān)重要。

模型動(dòng)物飼養(yǎng)在武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物房SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特點(diǎn)

門(mén)采用專(zhuān)用凈化密閉門(mén)并配備觀察窗。單向走道呈順時(shí)針走向設(shè)計(jì)。屏障系統(tǒng)內(nèi)共有大鼠飼養(yǎng)室1間，小鼠飼養(yǎng)室3間，隔離觀察室1間，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室1間，潔物存放室1間，清洗消毒室1間。此外，屏障系統(tǒng)外配有監(jiān)控室、機(jī)房和配電室等。

（2）設(shè)計(jì)參數(shù)

室內(nèi)溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數(shù)：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強(qiáng)梯度：20～50Pa；空氣潔凈度：7級(jí)；菌落數(shù)：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；動(dòng)物照度：15～20lx；晝夜明暗交替時(shí)間：12/12h。

（3）通風(fēng)和空調(diào)系統(tǒng)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用全新風(fēng)中央空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)?？諝饨?jīng)過(guò)初、中、三級(jí)過(guò)濾器后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境。

（4）照明系統(tǒng)

一更、淋浴、二更、氣閘、清潔走道、潔物存放處、污物走道、緩沖間和清洗消毒間、動(dòng)物飼養(yǎng)室、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備間、隔離觀察室和功能實(shí)驗(yàn)室等安裝有手動(dòng)和自動(dòng)開(kāi)關(guān)，根據(jù)實(shí)際需要，調(diào)節(jié)控制室內(nèi)照明燈。未啟用房間、清潔走道、潔物存放處、污物走道等在每日中午12點(diǎn)和晚上8點(diǎn)開(kāi)啟紫外線燈照射1h。

（5）通訊系統(tǒng)

因?yàn)镾PF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境和設(shè)施具有特殊要求，人員進(jìn)入后不能隨意出入，而室內(nèi)外的聯(lián)系又十分重要，故室內(nèi)各房間均安裝內(nèi)部電話機(jī)，按照房間順序編排電話號(hào)碼，各室內(nèi)電話可相互連通，并均與監(jiān)控室總機(jī)保持聯(lián)系，保證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)外信息的及時(shí)溝通。

（6）監(jiān)控系統(tǒng)

對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的出入口、走道、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室、功能操作室等重要位置均安裝了可作270°旋轉(zhuǎn)的攝像機(jī)，能夠及時(shí)了解設(shè)施的運(yùn)行狀態(tài)；也能有效督促實(shí)驗(yàn)人員執(zhí)行科學(xué)的操作規(guī)程，避免人為因素造成室內(nèi)環(huán)境和設(shè)施的污染；并對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的動(dòng)物狀態(tài)和反應(yīng)進(jìn)行觀察，減少對(duì)動(dòng)物的滋擾。

（7）供水系統(tǒng)

SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水以純凈水為宜。本實(shí)驗(yàn)室采用管道供水，將處理后的純凈水用塑膠管道輸送到屏障系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室，設(shè)置接水槽，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)滅菌的飲用水和屏障系統(tǒng)內(nèi)用水。要經(jīng)常更換和清洗輸水管道，清洗籠具的用水添加適當(dāng)比例的84消毒液。

（8）供電系統(tǒng)、警報(bào)系統(tǒng)和消防設(shè)施

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室要求全天候不間斷供風(fēng)和供電，如果出現(xiàn)故障，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和處理，就可能導(dǎo)致環(huán)境設(shè)施的污染、動(dòng)物感染或死亡，造成嚴(yán)重后果。因此應(yīng)對(duì)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室使用獨(dú)立穩(wěn)定的供電系統(tǒng)，并配備有應(yīng)急電源。在中央空調(diào)機(jī)房控制室安裝風(fēng)機(jī)故障警報(bào)系統(tǒng)，以便及時(shí)檢修和維護(hù)，保證設(shè)施的安全運(yùn)行。

（9）消毒滅菌設(shè)備

為防止外界物品進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室時(shí)所攜帶的細(xì)菌污染室內(nèi)環(huán)境和造成動(dòng)物交叉感染，按照不同物品的特性，進(jìn)行紫外線照射消毒、渡槽消毒液消毒或?qū)Ｓ玫臋C(jī)動(dòng)門(mén)真空滅菌器消毒。

（10）動(dòng)物飼養(yǎng)籠具

飼養(yǎng)大、小鼠的籠具聚碳酸脂材料的塑膠籠具，具有高透明、耐高壓、耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn)。通用的不銹鋼籠具長(zhǎng)、寬、高分別為40、30、20cm，適用于單籠飼養(yǎng)有特殊要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，配有底盤(pán)和食槽，確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有充足的采食和活動(dòng)空間，同時(shí)也保證室內(nèi)環(huán)境的清潔。

（11）墊料的選擇和使用

在使用塑膠墊料時(shí)，墊料是大小鼠直接接觸的鋪墊物，起到吸濕、保暖和造窩的作用。墊料的好壞直接影響到大小鼠術(shù)后的恢復(fù)、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能。目前，所使用的墊料主要有玉米秸墊料、刨花墊料。

（12）飼料配制

大小鼠的生產(chǎn)型飼料和維持型飼料必須嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行科學(xué)配制生產(chǎn)。每半年檢測(cè)一次飼料的微生物指標(biāo)和有效營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)，保證飼料的質(zhì)量。

小鼠鑒定結(jié)果解讀：

24#, 26#, 27#, 29# KO- PCR 反應(yīng)可以獲得~700bp條帶； WT- PCR 反應(yīng)可以獲得324bp 條帶，為雜合子。注：數(shù)字為鼠尾號(hào)，WT為C57BL/6J野生鼠，N為Nagative空白對(duì)照，M為DNA Marker。

① 24#，26#，27#，29#：-12678bp，+13bp/wt，編碼區(qū)完全刪除，KO 陽(yáng)性 agattttaagcaaaggggggaaaattaagc-----12678bp------TAGGGTCAGAATTctagacccctcaccctcctctcctcttacc

② 31#，34#：-12536bp/wt，編碼區(qū)完全刪除，KO 陽(yáng)性 ccaccacccccaattctgacccgatcccgc-----12536bp---agccagcagtgtggatggctagacccctca

③ 32#，33#：-12571bp/wt，編碼區(qū)完全刪除，KO 陽(yáng)性 tccaccaccacccccaattctgacccgatc----12571bp-----cctcctctcctcttacccaagtgcagggtg

1. 項(xiàng)目策略圖

此模型采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Crtc1基因進(jìn)行基因編輯，原理示意圖如下：

2. 項(xiàng)目策略概述

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄gRNA, 將Cas9、gRNA同時(shí)注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引導(dǎo)下結(jié)合到靶位點(diǎn)進(jìn)而造成DNA雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)堿基序列缺失，實(shí)現(xiàn)基因敲除。

3. gRNA序列信息

gRNA1: CACGCAAGTCCCAATTGCG (5’ – 3’), PAM: AGG.

gRNA2: CCCTTGCTAGAGATTCCG (5’ – 3’), PAM: AGG.

一、疾病概述 肺結(jié)核（Pulmonary tuberculosis，PTB）是世界高死亡率的嚴(yán)重傳染病之一。PTB是由各種分支桿菌菌株引起的，結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）大多在人類(lèi)中觀察到。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（世衛(wèi)組織）的報(bào)告，2017年全世界有1000萬(wàn)新病例PTB疾病和150萬(wàn)例死亡（世衛(wèi)組織，2018年）。 據(jù)估計(jì)，世界人口的三分之一是潛伏性感染的Mtb，其中5%至10%會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。主要癥狀為有較密切的結(jié)核病接觸史，起病可急可緩，多為低熱（午后為著）、盜汗、乏力、納差、消瘦、女性月經(jīng)失調(diào)等；呼吸道癥狀有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸悶或呼吸困難。肺部體征依病情輕重、病變范圍不同而有差異，早期、小范圍的結(jié)核不易查到陽(yáng)性體征，病變范圍較廣者叩診呈濁音，語(yǔ)顫增強(qiáng)，肺泡呼吸音低和濕啰音。晚期結(jié)核形成纖維化，局部收縮使胸膜塌陷和縱隔移位。在結(jié)核性胸膜炎者早期有胸膜摩擦音，形成大量胸腔積液時(shí)，胸壁飽滿，叩診濁實(shí)，語(yǔ)顫和呼吸音減低或消失。盡管有微生物治療，多達(dá)一半的結(jié)核病幸存者仍具有某種形式的持續(xù)性肺功能障礙。肺功能障礙，從輕微異常到嚴(yán)重氣喘，可增加呼吸道原因死亡的風(fēng)險(xiǎn)。快速診斷和有效治療對(duì)于控制PTB的傳播和降低其死亡率非常重要。盡管對(duì)PTB的機(jī)理研究開(kāi)展了了大量工作，但PTB進(jìn)展中的分子機(jī)制仍然不清楚。二、模型背景1、Igfbp5基因信息? 敲除基因名稱(chēng)（NCBI號(hào)）：16011? 敲除基因NCBI網(wǎng)址鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/16011? 敲除基因名稱(chēng)（MGI號(hào)）：Igfbp5（MGI: 96440）? 敲除基因Ensembl網(wǎng)址鏈接：? http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?g=ENSMUSG00000? 026185;r=1:72857932-72874884? 方案針對(duì)的轉(zhuǎn)錄本（Ensembl號(hào)）：ENSMUST00000027377.8? 方案敲除的exon：全部編碼區(qū)2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息 所采用的小鼠品系為C57BL/6。 來(lái)源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個(gè)亞系。1985年從Olac引到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。 毛色：黑色。 主要特性：①乳腺腫瘤自然發(fā)生率低，化學(xué)物質(zhì)難以誘發(fā)乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無(wú)眼。用可的松可誘發(fā)腭裂，其發(fā)生率達(dá)20%。③對(duì)放射物質(zhì)耐受力中等;補(bǔ)體活性高;較易誘發(fā)免疫耐受性。④對(duì)結(jié)核桿菌敏感。對(duì)鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產(chǎn)量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類(lèi)脂質(zhì)濃度低。對(duì)百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認(rèn)作"標(biāo)準(zhǔn)"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。主要用途：是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。3、研究背景 胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（Insulin growth factor binding proteins, IGGBPs）, 系胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin growth factors, IGFs）的結(jié)合蛋白家族，通過(guò)高親和力與IGFs結(jié)合調(diào)控IGFs發(fā)揮生物學(xué)功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，IGFs 在促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，調(diào)節(jié)免疫功能等方面發(fā)揮重要的生物作用；而現(xiàn)有的七種IGFBP與IGFs結(jié)合，延長(zhǎng)IGFs的半衰期，增強(qiáng)或者抑制IGFs的生物學(xué)作用[2]。IGFBP5, 分子量為28~30 KD，在大量細(xì)胞中均有表達(dá)，與IGF1與IGF2有較高的親和力。大量研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP5與肺組織的發(fā)育及部分疾病進(jìn)程相關(guān)。IGFBP5從妊娠第15天開(kāi)始表達(dá)，主要集中在近端氣道上皮細(xì)胞、質(zhì)間充質(zhì)和周?chē)艿拈g充質(zhì)，且隨著妊娠的進(jìn)行而增加，發(fā)現(xiàn)IGFBP5在胎兒肺發(fā)育過(guò)程中至關(guān)重要[3] [4]。另有研究報(bào)道[5]，IGFBP-5在體外和體內(nèi)均可誘導(dǎo)胞外基質(zhì)成分（例如膠原蛋白和纖連蛋白）的產(chǎn)生, 還可誘導(dǎo)原代人肺成纖維細(xì)胞遷移而加速肺纖維化進(jìn)程，可能與MAPK信號(hào)通路的激活相關(guān)。此外，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-19a-19b-20a[6]，熱休克蛋白70[7]在肺纖維化中的作用可能與介導(dǎo)了IGFBP5相關(guān)。大量研究表明IGFBP5與肺癌的發(fā)生及患者預(yù)后情況密切相關(guān)。有研究[8]發(fā)現(xiàn)在肺鱗狀細(xì)胞癌（SCC）中差異表達(dá)的基因，IGFBP5在肺腫瘤組織和十個(gè)正常支氣管上皮組織中存在顯著的表達(dá)差異。有研究采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)[9]： IGFBP5是轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中表達(dá)下調(diào)最顯著的基因之一，深入過(guò)表達(dá)、敲低實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IGFBP5抑制了骨肉瘤體外細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，且敲低IGFBP5后能逆轉(zhuǎn)腫瘤的進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)[10] circPIP5K1A通過(guò)靶向miR-661 / IGFBP5軸促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)展，間接表明IGFBP5在腫瘤中的作用及成為治療靶點(diǎn)的臨床意義。 因此，本課題與采用模型，探究IGFBP5在肺結(jié)核疾病中的潛在作用及分子機(jī)制，旨在為肺結(jié)核篩選疾病分子標(biāo)志物與尋求潛在治療靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1. Stiles, A.D. and A.J. D'Ercole, The insulin-like growth factors and the lung. Am J Respir Cell Mol Biol, 1990. 3(2): p. 93-100.2. Cohick, W.S. and D.R. Clemmons, The insulin-like growth factors. Annu Rev Physiol, 1993. 55: p. 131-53.3. Retsch-Bogart, G.Z., et al., Cellular localization of messenger RNAs for insulin-like growth factors (IGFs), their receptors and binding proteins during fetal rat lung development. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996. 14(1): p. 61-9.4. Price, W.A., et al., Insulin-like growth factor binding protein production and regulation in fetal rat lung cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1993. 8(4): p. 425-32.5. Yasuoka, H., Y. Yamaguchi, and C.A. Feghali-Bostwick, The pro-fibrotic factor IGFBP-5 induces lung fibroblast and mononuclear cell migration. Am J Respir Cell Mol Biol, 2009. 41(2): p. 179-88.6. Souma, K., et al., Lung fibroblasts express a miR-19a-19b-20a sub-cluster to suppress TGF-beta-associated fibroblast activation in murine pulmonary fibrosis. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 16642.7. Sellares, J., et al., Intracellular Heat Shock Protein 70 Deficiency in Pulmonary Fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 2019. 60(6): p. 629-636.8. Liu, Y., et al., Identification of genes differentially expressed in human primary lung squamous cell carcinoma. Lung Cancer, 2007. 56(3): p. 307-17.9. Su, Y., et al., Insulin-like growth factor binding protein 5 suppresses tumor growth and metastasis of human osteosarcoma. Oncogene, 2011. 30(37): p. 3907-17.10. Sun, Y., et al., circPIP5K1A serves as a competitive endogenous RNA contributing to ovarian cancer progression via regulation of miR-661/IGFBP5 signaling. J Cell Biochem, 2019. 120(12): p. 19406-19414.