為了研究Npsn在斑馬魚中性粒細(xì)胞中的功能，我們運(yùn)用CRISPER/Cas9技術(shù)對斑馬魚npsn進(jìn)行全基因組敲除，并且獲得了一系列npsn基因發(fā)生移碼突變的突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點(diǎn)獲得的（-7，+0）（npsnsmu5）突變體，和在exon6-Cas9靶點(diǎn)處獲得的（-0，+1）（npsnsmu6）突變體，并且經(jīng)預(yù)測它們的蛋白結(jié)構(gòu)相對于野生型斑馬魚出現(xiàn)移碼突變和提前終止。但是我們通過WISH檢測發(fā)現(xiàn)在npsnsmu5突變體斑馬魚中，npsn的信號幾乎是缺失的，并且qRT-PCR結(jié)果也同樣證明了在npsnsmu5突變體中npsn的mRNA水平下降到野生型斑馬魚的5%左右，可能是由npsn的無義突變導(dǎo)致了mRNA的全面降解所導(dǎo)致的。但是npsnsmu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大小和體型正常，并且是可以正常的產(chǎn)生后代。

為了研究Npsn缺陷是否影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育，我們通過斑馬魚中性粒細(xì)胞特異性標(biāo)記基因mpx和lyz的整體原位雜交，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體和野生型斑馬對比，mpx+和lyz+信號點(diǎn)的數(shù)量沒有明顯差別。蘇丹黑染色也同樣發(fā)現(xiàn)SB+陽性細(xì)胞的數(shù)量也沒有差異。并且進(jìn)一步在DIC下觀察npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚中性粒細(xì)胞中的顆粒，也未發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。以上結(jié)果表明，Npsn缺陷并不顯著影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的發(fā)育和數(shù)量。這可能是因?yàn)镹psn只是斑馬魚中性粒細(xì)胞中的一種酶顆粒，缺失后并不影響中性粒細(xì)胞的發(fā)育，但是可能影響了中性粒細(xì)胞的某些功能。

為了研究Npsn缺陷對斑馬魚中性粒細(xì)胞功能的影響，而中性粒細(xì)胞的主要功能是參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，因此我們做了斑馬魚大腸桿菌的侵染實(shí)驗(yàn)。我們利用顯微注射的方式感染npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚胚胎的卵黃囊，通過記錄并比較感染后兩者的生存率，發(fā)現(xiàn)npsnsmu5突變體在感染大腸桿菌后生存率相對于野生型胚胎顯著下降，體內(nèi)殘余的菌量明顯上升，并且在感染的早期階段，npsnsmu5突變體中炎性因子的表達(dá)水平比野生型明顯升高，這說明了中性粒細(xì)胞在抵抗細(xì)菌感染中存在功能缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Npsn在中性粒細(xì)胞抵抗感染中的作用，我們通過構(gòu)建斑馬魚Npsn過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時感染大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)Npsn過表達(dá)后能顯著提高感染后斑馬魚的存活率。這個結(jié)果進(jìn)一步表明，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細(xì)菌感染。

但是Npsn通過哪種方式來幫助中性粒細(xì)胞抵抗感染的呢？先前有體外實(shí)驗(yàn)證明，鯉魚的Npsn能夠水解纖連蛋白和明膠，而這兩種組分又是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，那么Npsn是否通過影響斑馬魚中性粒細(xì)胞的遷移來影響對大腸桿菌的抵抗的呢？為了驗(yàn)證這個觀點(diǎn)，我們觀察了在感染后4小時時傷口處中性粒細(xì)胞的數(shù)量，但是比較npsnsmu5突變體和野生型斑馬魚并沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。另外，Npsn作為一種水解酶，它能否能夠直接水解和破壞大腸桿菌細(xì)胞的完整性，進(jìn)而影響大腸桿菌在機(jī)體內(nèi)存活的呢？并且Npsn缺陷主要影響斑馬魚清除哪種類型的菌呢？為了驗(yàn)證這些問題，我們也將npsnsmu5突變體斑馬魚和野生型斑馬魚同時感染了其他類型的菌，如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌等，發(fā)現(xiàn)Npsn缺陷后可能增加斑馬魚對革蘭氏陰性菌的敏感性。但是Npsn影響斑馬魚中性粒細(xì)胞抵抗細(xì)菌感染的具體機(jī)制，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。另外npsnsmu5突變體可以作為斑馬魚免疫與炎癥反應(yīng)模型，對研究在感染過程中，中性粒細(xì)胞與病原菌的相互關(guān)系，以及對研發(fā)新的抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。

動物模型的制備和應(yīng)用實(shí)驗(yàn)必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1、模型的形態(tài)特征

患病小鼠四肢的腳趾、腳掌以及踝部關(guān)節(jié)會出現(xiàn)紅腫，嚴(yán)重則關(guān)節(jié)僵直，行動受阻。如圖1所示。

圖1：模型組小鼠發(fā)病后與對照組小鼠的足部狀態(tài)對比。（A）、（C）模型組小鼠腳趾、腳掌、踝部關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫。（B）、（D）對照組小鼠不發(fā)病，足部狀態(tài)正常。

對小鼠的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，如圖2所示。模型組小鼠在第3天發(fā)病，病情在第9~10天達(dá)到一個高峰狀態(tài)；第10~11天可選擇性地再次注射25~50μg LPS，延長發(fā)病周期，病情加重，在第14~15天以后病情逐漸緩解。若不進(jìn)行二次注射，炎癥癥狀則從第11天開始逐漸下調(diào)。

圖2中（A）顯示模型組小鼠在第8天發(fā)病率達(dá)到100%，對照組全部不發(fā)病，故在圖中不予顯示。（B）顯示模型組小鼠四肢發(fā)病數(shù)平均在3~4肢，在第12天病情達(dá)到最高峰，對照組不發(fā)病。（C）為對關(guān)節(jié)炎發(fā)病程度的評價，測量小鼠的踝部關(guān)節(jié)以及腳掌腫脹厚度，根據(jù)病情嚴(yán)重程度為其打分：足部無紅腫，不發(fā)病——0分；1~2個腳趾紅腫，或有輕微的紅腫或紅斑——1分，3~5個腳趾紅腫或足部有較明顯的紅腫——2分；整個足部嚴(yán)重紅腫，關(guān)節(jié)僵直——3分；每只動物最高分?jǐn)?shù)為12分。對照組不發(fā)病故全部分?jǐn)?shù)為0。

圖2：統(tǒng)計小鼠足部發(fā)病情況。（A）發(fā)病率（B）四肢發(fā)病的數(shù)量（C）病情評價打分

2、模型的病理特點(diǎn)

（1）組織切片染色進(jìn)行病理學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第18~19天，處死動物收集樣本。取小鼠四肢（主要為足部部分）浸沒于10%中性福爾馬林中進(jìn)行固定，隨后經(jīng)甲酸脫鈣后，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察。

如圖2顯示，（A）、（C）為模型組小鼠樣本，表現(xiàn)為軟骨受侵蝕，關(guān)節(jié)囊纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤，骨質(zhì)受破壞，滑膜細(xì)胞脫落，腔內(nèi)積液等。（B）、（D）為對照組，其軟骨面完整平滑，無增生與積液現(xiàn)象，表現(xiàn)正常。

圖3：小鼠足部樣本HE染色。（A）模型組：軟骨侵蝕，關(guān)節(jié)囊纖維組織增生，炎細(xì)胞浸潤，骨質(zhì)破壞。（C）模型組：軟骨面破壞，滑膜細(xì)胞脫落，有積液。（B、D）對照組：正常。

（2）CT檢測骨骼損傷情況

將經(jīng)10%中性福爾馬林固定后的小鼠足部樣本進(jìn)行CT掃描拍片，觀察其足部的骨骼損傷情況。如圖4所示，（A）、（C）圖中為模型組小鼠骨骼，骨骼表面不平整，扭曲變形，新生骨與破骨并存，骨骼損傷嚴(yán)重。（B）、（D）為對照組，骨骼表面與腔內(nèi)平滑，正常無損傷。

圖4：小鼠足部樣本CT。（A）模型組表面俯視圖（B）對照組表面俯視圖（C）模型組截面圖（D）對照組截面圖

（3）模型組織中細(xì)胞因子表達(dá)情況的分析

檢測小鼠關(guān)節(jié)與血液中幾種主要的促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況，如圖5所示。其中IL-6、IL-17、TNF-α都是在炎癥反應(yīng)中起重要作用的促炎性細(xì)胞因子。IL-6對破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收、滑膜炎等炎癥進(jìn)程起關(guān)鍵作用，也是機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志性細(xì)胞因子。IL-17是一種主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，在T細(xì)胞介導(dǎo)的滑膜炎、骨破壞等過程起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，是關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中最標(biāo)志性的調(diào)節(jié)因子之一。TNF-α能夠促進(jìn)粘附分子和蛋白酶表達(dá)，在骨破壞以及滑膜細(xì)胞增生等過程中起重要作用[3]。因此，這些促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平反應(yīng)了病情的嚴(yán)重程度。

取得小鼠關(guān)節(jié)樣本，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過Real-Time PCR檢測關(guān)節(jié)中促炎性因子的相對表達(dá)量；提取小鼠血清，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，檢測血清中促炎性因子的表達(dá)量。雖然在取樣時間段（第18~19天）炎癥反應(yīng)正逐漸下調(diào)，關(guān)節(jié)與血清中的IL-6、IL-17、TNF-α的表達(dá)量仍然高于正常水平。

圖5：（A）關(guān)節(jié)中炎癥因子的相對表達(dá)量（B）血清中炎癥因子的表達(dá)水平

1、實(shí)驗(yàn)動物

C57BL/6J小鼠，屬動物界、脊索動物門、哺乳綱、嚙齒目、鼠科、小家鼠種（Mus musculus），1921年Abby Lathrop得到動物后開始近親交配，育成數(shù)個近交系。本實(shí)驗(yàn)中于SPF級動物房飼養(yǎng)。

2、模型構(gòu)建

使用8~9周齡的C57BL/6J雌性小鼠，分為兩組，每組各6~7只。

關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)試劑為Chondrex公司生產(chǎn)的Arthrogen-CIA?ArthritogenicMonoclonal Antibody試劑盒。

對于模型組小鼠，每只腹腔注射5mg膠原抗體混合物，記為第0天，第3天時腹腔注射25~50μg LPS，能夠快速誘導(dǎo)發(fā)病；第10~11天可選擇性地再次注射25~50μg LPS，使加重病情，延長發(fā)病周期，繼續(xù)觀察。對照組在同樣的時間腹腔注射等體積的PBS。

一、疾病概況

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以滑膜持續(xù)炎癥和關(guān)節(jié)軟骨及骨破壞為特征的慢性進(jìn)行性的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜炎及對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鳌A在我國的發(fā)病率為0. 26%~0. 5%，能夠發(fā)生于任何年齡，女性發(fā)病多于男性[1]。RA炎癥反應(yīng)造成患者機(jī)體肉芽組織和纖維增生，使得關(guān)節(jié)腔內(nèi)的血供嚴(yán)重受損；嚴(yán)重的缺血使得局部出現(xiàn)壞死，以累及周圍關(guān)節(jié)為主，故其基本病理改變?yōu)榛ぱ譡2]。主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛，繼而軟骨破壞、關(guān)節(jié)間隙變窄，晚期因嚴(yán)重骨質(zhì)破壞、吸收導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵直、畸形、功能障礙。

該疾病為一種反復(fù)發(fā)作性疾病，致殘率較高，預(yù)后不良，目前還沒有很好的根治方法。

二、發(fā)病機(jī)制

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病的主要因素有：（1）B細(xì)胞的介導(dǎo)作用與自身抗體的產(chǎn)生；（2）T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的介導(dǎo)作用與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)；（3）遺傳因素。但就目前來講，RA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，其可能與具有某些遺傳特征的人群對一些抗原刺激具有敏感性而引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)所導(dǎo)致的病理性改變有關(guān)。免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、功能障礙是導(dǎo)致RA的主要機(jī)制，在RA患者的滑膜組織中出現(xiàn)異常增多的T、B淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞介素、趨化因子、干擾素等細(xì)胞因子以及自身抗體等均提示這些物質(zhì)有可能參與RA的發(fā)生和發(fā)展[1]。